【基因】TP53基因突变与药物

3、为什么抑癌基因的靶向药物开发较难

影响肿瘤发生的基因分为两类：

一种是原癌基因，如EGFR、ALK、KRAS等，这些基因发生了激活突变，驱动了肿瘤的增殖，它们可以比作是汽车的油门，正常时候轻微踏上，结果突变的癌细胞却一直踏着，而且松不开了，因此使用相应的靶向药物去阻断，达到抗肿瘤的目的。

一般原癌基因的突变是只在特点的点发生突变才能使得蛋白具有更强的活性，不是随便哪个位点或者那种形式突变都可以的，如EGFR的19del、L858R这些位点，只有这些位点的特点突变形式才能造成EGFR蛋白特定的构象改变，蛋白持续激活，所以针对这些特定的突变位点开发靶向药物稍微容易些。

第二种基因是抑癌基因，如TP53、BRAC1或BRAC2、PTEN、RB1和APC等，它们负责调控肿瘤细胞的增殖，就像是汽车的刹车一样。

需要注意的是抑癌基因的突变是比较随机的，基因的任何位置、不管发生任何形式的突变，只要这个突变导致该基因失去功能，或者功能降低，都可能影响到肿瘤的发生。这就导致针对某个抑癌基因开发直接的靶向药物非常困难。比如一个提前终止导致的抑癌基因突变，已经没有了这个基因翻译的功能蛋白了，还能使用什么药物去阻断呢？现在更多的是在信号通路的上下游想办法，找相应的药物靶点。

图2 肿瘤抑癌基因TP53、PTEN、RB1和APC的突变形式、频率

那么，针对TP53的靶向药为啥那么难产？这和TP53的功能有关。正常情况下，TP53的一个很重要的功能是在细胞复制的过程中检查全部DNA是不是完美复制了。如果有错误，TP53会让细胞停在G1关卡，只有修复成功的才能继续分裂，修复不成功的细胞就会自行凋亡。

所以说，正常的TP53就像是刹车（抑癌基因）。但肿瘤细胞的惯用伎俩就是把刹车弄坏，于是就这样了……复制出错的细胞轻松通过G1关卡，此时细胞G2关卡的修复成为重要的决定因素。

G1和G2两个关卡修复的内容不同，G2关卡不能修复前面累积的问题。G2关卡的修理匠们觉得修复好了，就会放行肿瘤细胞，如果没修复好，也会导致肿瘤细胞凋亡。当然，最直接的方法可能是把大刹车TP53修复好，但是，肿瘤细胞内的TP53基因常常各有各的“坏法”，我们用药物个性化一一修复起来太困难！

虽然TP53套路深，但科学家们曲线救国，发现带有TP53突变的肿瘤细胞其实也是有弱点的—TP53突变的肿瘤细胞虽然没了刹车，跑（分裂增殖）得快，但是，跑得快就容易出状况，这时候对于G2关卡修复能力的依赖性就大大增加。G2关卡上的修理匠们包括：Wee1，Chk1/2，CDC25等。针对这些关卡，科学家们进行了大量的研究，开发出相应的药物，下文将会举例说明。

4、TP53基因的突变情况

TP53是一个抑癌基因，很多患者的基因检测报告发现有该基因的突变。该基因的错义突变、插入或缺失造成的失活突变非常常见。但是如上面所述，TP53的基因突变形式、突变的位点非常复杂，也非常多样性，不大可能完全一致，错义突变更多的降低TP53基因的功能，而无义突变则可能把TP53基因完整地废掉了。原则上TP53的基因突变可以发生在任何地方，因为只要是突变导致P53蛋白失去了功能即可，如下图4所示。

临床研究证实肿瘤中95.1%的TP53点突变主要发生在高度保守的175、245、248、249、273和282位点，图2的外显子测序检测到的突变分别非常零散，但可能很多突变对肿瘤的发生没有太大影响。

TP53基因可以在多个肿瘤类型里发生，不同肿瘤类型中TP53基因的突变频率不同，最高的是子宫癌肉瘤，肺腺癌居然也达到了60%多。

TP53基因在约90%的小细胞肺癌（SCLC）和约50%的非小细胞肺癌（NSCLC）中发生改变。大部分（70%-80%）突变是错义点突变，绝大多数影响了DNA结合结构域（5-8号外显子），偶见纯合型缺失。

肺癌中TP53突变与吸烟有关，与非吸烟的肺癌患者相比，常在吸烟的肺癌患者中发现由烟草致癌物质导致的G-T的颠换。当在突变或缺失的P53的肺癌细胞中重新表达野生型的P53时，肿瘤细胞走向凋亡，临床试验证实了TP53基因治疗的抗肿瘤活性、可行性和安全性。

一项涵盖12个肿瘤类型，共计3281例肿瘤的检测发现，TP53的平均突变频率约为42%，所以很多基因检测报告测出来TP53突变是正常的，因为这个基因突变频率确实很高。而且研究者已经证实，该基因如果发生突变，肿瘤往往更具侵袭性，预后较差。

虽然血液肿瘤里TP53突变突变频率较低（5%-15%），但是该基因突变与临床结果相关度最高，TP53基因突变导致异常核型，较差的预后。

也有研究报道，如果晚期卵巢浆液性腺癌患者发生TP53突变，则对化疗产生抗性。如果存在TP53基因的失活突变，则头颈部鳞状细胞癌的患者进行手术治疗的预后较差。与此相反，如果是非小细胞肺癌（NSCLC）存在TP53基因的非失活突变，则生存期较短。

5、针对TP53基因突变的药物

目前，美国FDA没有批准任何针对TP53的靶向药物，针对TP53突变的基因疗法、靶向肿瘤疫苗和抗癌药物正处于临床试验早期，这些药物包含APR-246、MK-1775、ALT-801、Kevetrin。

也有研究携带TP53突变的癌细胞对Aurora A激酶抑制剂Alisertib敏感，该药用于治疗非小细胞肺癌的研究正处于临床II期研究当中。

另外，研究表明TP53基因突变可能会影响放射治疗的效果。在肿瘤细胞里导入野生型的TP53基因，重建P53蛋白功能，有助于增加肿瘤对传统放射治疗、化疗的敏感性，这也比较好理解，传统治疗破坏DNA，但是DNA损伤的癌细胞会被P53蛋白阻断，进入凋亡程序，如果P53蛋白失活了，癌细胞就失去了一个检查点，这也可能是为何这么多肿瘤都存在TP53的突变，部分也是一种肿瘤在进化上的选择。

针对TP53的药物作用机理主要有以下几种：

1、突变P53蛋白功能再激活，如APR-246可以使突变型P53蛋白重新折叠为和野生型P53蛋白相同的构象，有效激活下游信号分子。

另外PRIMA-1还可诱导HSP90的表达，HSP90和突变型的P53蛋白形成复合物，具有与野生型P53类似的转录激活功能。也有研究表明，PRIMA-1还可以增加肿瘤细胞对药物的敏感性。需要注意的是PRIMA-1主要是针对TP53基因的点突变，如果是截断突变就不适合这类药物。

2、特异性阻断MDM2/MDM4与P53的相互作用，人体内的P53蛋白活性是被负调控的，MDM2/MDM4就是这样的负调控蛋白，也有药物研发的思路是开发针对MDM2/MDM4的抑制剂，将P53蛋白的功能给释放出来。临床研究表明Nutlins-3单独使用，或与化疗联用可有较好的临床效果。类似的药物还有MI-63、Kevetrin等。

其他的治疗措施包含野生型TP53基因导入的基因治疗，以及利用TP53基因的突变，进行协同致死疗法。所谓的协同致死是既然TP53这么重要的基因在肿瘤细胞里失活了，那么就干脆再敲掉一个关键的基因，导致肿瘤细胞凋亡，这个与卵巢癌的靶向药物奥拉帕尼思路是一样的。

图5 TP53基因相关的靶向药物

需要指出的是，目前FDA没有批准针对TP53突变的任何靶向药物，即便是临床药物，也是针对不同的位点。如APR-246是针对TP53基因的三个热点突变R273、R175和R248，如果是一个失活突变，或者不是这三个位点，那么选择参加这种药物的临床试验收益可能会打折扣。

MK1775（后来被AZ购买，于是改名AZD1775）是Wee1抑制剂，它针对的就是Wee1关卡。科学家们设想把Wee1干掉，然后让肿瘤细胞没得修复，自生自灭，而正常细胞由于还有TP53在G1关卡起作用，仍然不受影响。考虑到自生自灭的效率可能有点低，所以，又想出一招：Wee1抑制剂联用损伤DNA的化疗药物，让损伤来得更猛烈些！

图6 AZD1775抑制机制示意图

Wee1抑制剂联合卡铂的II期临床试验，在特别难治的铂类耐药的卵巢癌中取得了不错的效果—在24位入组的患者中21位完成了临床试验，其中1例患者达到了完全缓解（CR，青色），8位患者部分缓解（PR，黄色），7位患者病情稳定（SD，灰色）。其中2例患者的良好反应持续31~42个月。

图7 AZD1775联合卡铂的II期临床试验结果

这里需要提醒大家的是，AZD1775联合卡铂在卵巢癌II期临床试验中取得了不错的效果，并不代表在其他癌种中也能取得良好的疗效，比如肺癌、肝癌，情况是不同的。目前正在进行AZD1775在这些癌种中的临床试验。

6、一些TP53基因突变的最新研究成果

Laura Attardi教授团队在TP53基因上发现了一组“神突变”，竟然表现出来超级强大的抑癌效果，可以让“癌中之王”—胰腺癌在易感小鼠400天内的患癌率从40%降至0！400天算是小鼠的半辈子了，能预防五年生存率只有8%的胰腺癌！Attardi教授团队的这一重要发现，发表在2017年10月9日的《细胞》子刊《癌细胞》上。

Attardi教授的团队一直在努力攻克P53究竟是如何抑癌的这个谜题。在2011年，团队就发现P53蛋白两个转录激活功能域（TAD）中分别存在两组有趣的突变，她们把TAD1区的第25和第26个氨基酸分别换成谷氨酰胺和丝氨酸，把TAD2区的第53号和54号氨基酸换成谷氨酰胺和丝氨酸（简称TAD1区突变和TAD2区突变）。

图8 小鼠TP53基因两个TAD区突变的位置示意图

研究人员利用胰腺癌易感小鼠模型对比了TAD2区突变、P53野生型以及存在其他位点突变的5种小鼠的发病率。结果让人吃惊—只存在TAD2区突变的小鼠，在400天的随访期内无一患癌，存活率100%，而TAD2区未出现突变的小鼠患癌率已达40%。

Attardi教授表示：“并不是说有这种突变的小鼠就永远不会患癌，但这一实验证明这种突变存在相当强的限制肿瘤生长能力。” 进一步分析后，研究人员推断TAD2区突变的P53→Ptpn14→Yap这条信号通路可能就是这种突变发挥强力抑癌作用的关键。

再经过验证分析，这样的现象还可以在多种胃肠道癌症中被观察到。如果因突变出现了Ptpn14的表达水平升高，患者整体生存期还可改善，因此TAD2区突变的p53→Ptpn14→Yap通路的价值可能不限于胰腺癌治疗。

本次研究的实际价值是什么呢？

第一，相较此前被发现的P53突变，TAD2区突变不仅可以抑癌，还不会对小鼠产生影响寿命等副作用。因此如果开发一种模仿“超级抑癌突变”的药物，理论上可以达到同样的强力抑癌效果。

第二，在TAD2区突变的P53→Ptpn14→Yap通路中，P53失活，会导致Yap过度激活，促进癌症的生长，因此可以考虑利用Yap抑制剂治疗携带TP53突变的癌症患者。这一块儿更大的优势是，现在已经有FDA批准的Yap活性抑制药物，或许从这个角度出发，我们可以更快的找到治疗P53失活的癌症患者的药物。

德国德累斯顿工学院科学家开发出一种 “P53报警器”，能够监测细胞中P53的正常功能，一旦P53发生突变，它将立刻启动“自毁程序”，炸掉这个要“叛变”的细胞，这一成果发表在2017年11月13日的《自然通讯》上。

作者的研究思路是从源头上消灭这种突变，利用合成生物学的思路，设计一个“报警器”，让它感应P53蛋白，只要P53不正常在岗，细胞立马完蛋，从源头上就遏制了它们叛变的心。

这个“报警器”选择了单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦（HSV-TK/GCV）系统，研究者给TP53突变了的癌细胞和没突变的癌细胞都安上报警器，给同一只小鼠种上，再给小鼠打点GCV，结果就是TP53没突变那边肿瘤岿然不动，突变的肿瘤全死光了。

图9 小鼠实验结果

左：对照组小鼠77天/56天

右：注射GCV的小鼠86天/82天，可见敲除P53基因的肿瘤（L）停止生长、体积缩小；P53正常的肿瘤（R）继续生长

7、诱发TP53基因突变的因素

假如TP53基因可比作人体的卫士，那么一定要多加注意不能让其突变，或者说减少刺激其突变的因素。这其实就是一种防癌或预防。有研究表明，一些环境和饮食等会直接导致TP53基因的突变：

食物中的黄曲霉素B1，所以一定要注意不要使用发霉的食物，这些食物里可能有黄曲霉素。

乙型肝炎病毒感染，这会导致肝细胞癌，其中也涉及到TP53的变化。

非黑色素瘤皮肤癌的TP53基因突变与太阳的紫外线接触有关。

吸烟可引起TP53突变，与肺癌的发生相关。

未来十年，科学家们将对P53蛋白在代谢、生殖、生育、生殖细胞基因组失稳、肿瘤、生物寿命等众多领域里的作用进行更深入的研究，同时也将利用TP53基因的突变情况来判断患者的预后情况，开发新的治疗药物，以及选择合适的治疗方案等。除了肿瘤之外，P53蛋白可能还在其它的疾病中发挥重要作用，一定会有更多更大的惊喜在等着我们。